小鼠PD-1及其配体PD-L1胞外区基因的原核表达及亲和性

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小鼠PD-1及其配体PD-L1胞外区基因的原核表达及亲和性

吕开绩;陈旭东;程开;王路得;朱进顺;Kamara Saidu;张丽芳;朱冠保

【期刊名称】《温州医科大学学报》 【年(卷),期】2018(48()06)

【摘 要】目的：制备小鼠PD-1胞外区（mPD-1）与其配体PD-L1胞外区（mPD-L1）原核表达蛋白,并制备mPDL1兔多克隆抗体,在体外对mPD-L1和mPD-1的结合亲和性进行验证。方法：通过分子克隆方法分别构建重组质粒pET21a/mPD-L1和p GEX4T-1/mPD-1,并通过原核表达系统制备相应的重组蛋白并纯化,通过Western blot进行鉴定;将纯化的mPD-L1蛋白免疫健康日本大耳白兔制备兔多克隆血清抗体,用ELISA、Western blot分析得到的多克隆抗体的效价和特异性,并且将该多克隆抗体作为免疫荧光的阳性对照。最后应用ELISA和免疫荧光验证mPD-1与其配体mPD-L1蛋白的亲和性。结果：SDS-PAGE和Western blot结果显示原核表达的重组蛋白与预期大小一致,mPD-L1和mPD-1分别为25 kDa和40 kDa。经mPD-L1蛋白免疫后的日本大耳白兔能够产生特异性抗体,抗体效价在免疫后第6周达到高峰,Western blot检测结果显示多克隆血清可特异性识别mPD-1。ELISA结果表明,原核表达的mPD-L1蛋白能够和mPD-1蛋白结合,实验组OD450值明显高于对照组。免疫荧光结果显示,在小鼠PD-L1阳性细胞B16（小鼠黑色素瘤细胞株）的胞膜区出现绿色荧光团块。结论：利用原核细胞表达并纯化后获得mPD-L1和mPD-1蛋白,并在体外成功验证了mPD-L1和mPD-1之间的结合特性,为后期利用mPD-1和PD-L1的生物学特性研究提供了基础。

【总页数】8页(P401-407)


【作 者】吕开绩;陈旭东;程开;王路得;朱进顺;Kamara Saidu;张丽芳;朱冠保 【作者单位】[1]温州医科大学附属第一医院胃肠外科,浙江温州325015;;[1]温州医科大学附属第一医院胃肠外科,浙江温州325015;;[1]温州医科大学附属第一医院胃肠外科,浙江温州325015;;[2]温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室,浙江温州325035;;[2]温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室,浙江温州325035;;[2]温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室,浙江温州325035;;[2]温州医科大学分子病毒与免疫研究所微生物学与免疫学教研室,浙江温州325035;;[1]温州医科大学附属第一医院胃肠外科,浙江温州325015 【正文语种】中 文 【中图分类】R392.7 【相关文献】

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