微生物检测 实习总结

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时间荏苒，岁月如梭，自2012年8月13日起至现在，我已在贵公司实习了4个月。实习期间，我收获颇丰，现将我的一些体会总结如下：

实习内容：开展微生物检测项目，目前已完成4个检测项目，细菌总数、总大肠菌群、粪大肠菌群、大肠埃希氏菌。

1、菌落总数：食品、自来水、生活污水中的检测以及对实验室超净工作台操作环境的监控

取样：保持无菌环境，贮藏及保存待测样品的容器需无菌处理。食品分为固态和液态，液态可直接抽取25mL进行稀释，固态称取25g样品于225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液中，捏碎食物，拍击混匀，吸取混匀样品进行检测时注意不要吸入食物颗粒，以免影响菌落总数的观察。自来水取样时，需对水龙头进行无菌处理，火焰灼烧或75%酒精消毒，开放水龙头1-3min后再采集。

接种：事先将需要用到的器械或容器进行灭菌处理，整个操作环境要保持无菌，超净工作台及接种室用紫外灯灭菌30min以上，灭完菌30min后才能进入，避免吸入过多臭氧。接种过程中避免带入手上及衣物上的杂菌，所以操作过程及需无菌的用具不要在手下方完成或放在手下方。水样的稀释过程谨记一个原则-混匀。倾倒的培养基要适量，过多容易粘在平皿壁和盖上，造成数据不准确。影响实验成功或失败最为重要的一环节是水样和培养基一定要摇匀，摇匀过程中力度需控制好且一定要稳。生活污水检测时，水样的稀释度要选对，过大或过小都会造成检测失败，这个需要经验的积累。

培养过程：避免杂菌的污染，尽量选用大小配套的平皿，且平皿需倒扣，严格按照国标的培养温度、时间进行培养。

2、总大肠菌群：多管发酵法和酶底物法

多管发酵法：乳糖初发酵试验——EMB划线分离——革兰氏染色实验——复发酵试验

酶底物法：水样稀释——取100mL水样或稀释水样加入MMO-MUG粉末培养基——溶解、摇匀——倒入51孔无菌定量盘——24h后观察颜色变化

检测过程中需注意不要混入杂菌，移液枪取液体的时候比较容易污染，需先把枪外部的裸露部分用酒精擦过，枪头灭菌，插枪头时先把枪内的空气排尽。

检测成败关键是水样的稀释度要选对。多管发酵法一般采用的是15管发酵


法，选取3个稀释度，每个稀释度接种5管，为避免稀释度选的不对，可以额外多加几个稀释度进行实验，最终计数时选取适宜的3个稀释度进行计数。

乳糖初发酵试验和复发酵试验观察的是产气产酸情况，所以试管内一定要加杜氏小管，切不可忘记。

EMB划线分离时先配置伊红美蓝琼脂平板，倒好培养基凝固后可于培养箱中空培养一段时间，将冷凝在培养基表面和壁上的水珠蒸发掉，以便于划线和划出单菌落。

革兰氏染色时注意要挑取可疑的单菌落进行镜检，挑取的菌不要太多，涂片要薄而均匀，每次制片2-3片，不要贪多，因为染色步骤较多，且有染色时间限制，番红复染时，时间不要过长，以免出现假阴性。

镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌的同时需接种乳糖蛋白胨培养液复检。 酶底物法操作较简洁，但需注意稀释和倾倒培养基、液体时，手上的杂菌不要落入，封口时要尽量排净空气。注意水样要混匀，检测的结果才更准确。

3、粪大肠菌群：采用多管发酵法

乳糖初发酵试验——转接EC培养基中培养——产气者转于伊红美蓝琼脂平板——鉴定有无典型菌落

从总大肠菌群乳糖发酵试验中的阳性管数（产气产酸）中取1滴/1-3环转接于EC培养基中，44.5℃培养24h，如有产气者转种于伊红美蓝琼脂平板上，44.5℃培养18-24h，有典型菌落者则证实为粪大肠菌群。

此实验温度非常重要，因为自然环境中的大肠菌群在有营养物质的条件下也可以繁殖，通过提高培养温度将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开，只有在44.5℃生长的大肠菌群才称之为粪大肠菌群。

接种完需立即放于44.5℃恒温培养箱中培养，不要在室温下放置太长时间，易混入自然环境中的大肠菌群。

4、大肠埃希氏菌：采用的是多管发酵法和酶底物法

多管发酵法：乳糖初发酵试验——转接于EC-MUG培养基中培养——荧光检测

酶底物法：水样稀释——取100mL稀释水样或水样加入MMO-MUG粉末培养基——溶解、摇匀——倒入51孔无菌定量盘——24h后观察荧光

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