林木生物技术

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(考)生物技术（biotechnology）也称生物工程又称为分子克隆（molecular cloning）或基因的无性繁殖。 丁酸NAA奈乙酸NOA奈氧乙酸

子繁殖难以保持后代性状一致的三倍体植物

（bioengimeering）、生物生产技核酸的物理化学性质 术，指以现代科学为基础，结

合先进的工程技术手段和其它基因工程指将一种或多种生物基础学科的科学原理，按照预体（供体）的基因或基因组提先的设计，来改造生物体或加取出来，或者人工合成基因，工生物原料，为人类生产所需按照人们的愿望，进行严密的产品或达到某种目的的技术方设计，进行体外加工重组，转法。

移到另一种生物体（受体）的生命科学：研究探明生命现象细胞内，使之能再受体细胞遗的学问，特别对高等生物具有传并获得新的遗传性状的技知觉（感觉）、记忆，思维等高术。

层次现象的理解探求的精神科载体（vector）指基因工程中携学，或者心理学，社会学等的带外源基因进入受体细胞的人文科学，及生——共同构成“运载工具”。它的本质是DNA的更高层次的科学。

复制子。

现代生物技术是由多学科综合茎尖培养：组织培养中外植物而成的一门新兴学科。它包括体取自植物茎尖生长点

了分子生物学，细胞生物学，质粒（planmid）是广泛存在于微物学，免疫学，人体生理学、宿主细胞 (细菌、某些蓝藻、动物生理学，植物生理学，生绿藻和真菌体细胞中) 染色体物物理学，遗传学等与生命科外的一种裸露的双链DNA分学有关的学科。又结合应用了子。

化学，化学工程学，数学，微质粒载体构建指在天然质粒的电子技术，计算机等基础学科基础上，根据基因工程的需要的尖瑞技术，从而形成一门多除去一些非必需元件，添加一学科互相渗透的综合性学科。些必需元件，使其成为一种即所有构成生——的学科中，又带有一种强选择标记，又具有以基因工程（DNA片段的转移，低分子质量，高拷贝，能插入移植技术，转基因）为核心学外源基因且不影响复制，多种科。

限性内切酶单一切割位点等优植物生物技术:指对植物品质点的理想载体。例pBR322载和性状进行改造的生物技术,包体的构建

括P组织培养,人工种子,细胞目的基因导入是指:通过某种工程,基因工程等生物技术. 特定的途径将目的基因导入受(考)P组织培养概念:利用植物体细胞，使之整合到受体细胞体的器官，组织或细胞，通过基因组中，实现其功能表达的无菌操作接种子人工配制的培过程.

养基上，在适当的环境条件下基因枪法（gene gun）又称微培养，使之生长发育的技术，弹轰击法（micrkprojectile 叫组织培养。（plant tizzue bomboard ment）粒子轰击法cultune）。

（partide bombardment）是借由于培养物脱离了植物母体，助高速金属微粒将DNA分子在试管中生长，所以也叫离体引入活细胞的转化技术.

培养（culture in vitno）。 (考)转化率:指再生出转基因植组培所用的材料称为外植体株的受体数与轰击受体数的百（explant）

分比.(水稻,的转化率一般不到原生质体:指采用机械或酶解10%.

发去掉细胞壁的裸露细胞. Bt基因——从微生物苏云金杆原生质体方法:主要有三种,即菌分离出的苏云杆菌杀虫结晶液体浅层培养法,固体培养法,蛋白质基因。

液固结合培养法.

CpTi——从豇豆中分离出的豇目的基因指现有生物群体中控豆胰蛋白酶抑制剂基因

制某个优良性状的相关基因。 Iec tingene——植物凝集素基致病基因在特定情况下同样可因。

作为目的基因。故目的基因为转基因生物: 通过转基因技术在研究开发所需的基因产物中获得的生物体

的相应的基因。

转基因技术:通过基因工程技遗传工程一般认为，遗传工程术对生物体进行基因移植，使是按照人们预先设计的蓝图，生物体获得新的优良特性。 将一种生物的遗传物质绕过有胚胎培养:即用胎、胚珠、珠心、性繁殖导入另一种生物中去，胚乳子房为材料进行培养。 使其获得新的遗传性状，形成器官培养:取植物根、茎、叶、新的生物类型的遗传操作。 花or幼果的部分组织进行培有广义和狭义之分，广义指细养。

胞工程和基因工程，狭义就指植物遗传转化：又称基因或植基因工程，一般所说的遗传工物基因工程，其要研究的关键程及指基因工程。

是利用重组DNA，细胞组织培基因工程是对DNA分子的重养或种质系统转化等技术，将组拼接，所以也叫重组DNA技外源基因导入植物细胞或组术（recombinant DNA 织，使之之定向重组遗传物质，technology）。在这个过程中，改良植物性状，培育优质高产DNA重组分子大都需要在受体作物新品种。

细胞中复制扩增，故基因工程翻译：IAA吲哚乙酸IBA吲哚

芽尖培养（bud tip）2副芽培养茎尖培养实验结果: （axillary bud）3苗端培养1,定芽的形成，

(shoot apex) 4苗尖培养(shoot 2不定芽的增殖及伸长 tip) 5分生组织培养（meristem）3发根处理

6 顶端培养(tip) 生物技术茎尖脱毒的一般流程： （biotechnology）也称生物工程1健壮的带毒植株

（bioengimeering）基因枪法2活体栽培条件下长期进行（gene gun）

36~38度热处理，保证植株生长供体、载体和受体称为基因工旺盛

程的三大要素

3顶芽离体消毒编号，取0.2~0.5基因工程载体的类型：

或1.0mm的茎尖，做液体震荡质粒载体，噬菌体载体（包括培养

以噬菌体和质粒为基础构建的4继代培养，增殖芽丛

Cosmid载体）、人工染色体载5将部分嫩茎转到固体培养基体（YAC、BAC、PAC和TAC）上，壮苗生根

等。按照应用的对象的不同又6移栽到已消毒的环境栽培，各可以分为原核生物克隆载体、编号植株之间互相隔离 植物克隆载体和动物克隆载体7病毒检测

等，按照表达的方式可以分为目前用于P基因工程的载体系正向表达载体和反向表达载统有如下三种：1共整和载体系体。

统，2双元载体系统，3隔端载花药培养的条件：25摄氏度，体系统（SEV）

18小时光照。 原生质体培养的意义(应用) Ti质粒的结构：

1种质资源保存 1,T-DNA区，2，Vir区（毒性2原生质体融合, 区）3,Con区4，Ori区， 3筛选突变体, 花药与花粉培养的意义 4遗传转化, １培育纯系后代 5基础研究.

２提高选择效率 核酸的功能（生技P23） ３用于遗传研究

1）携带遗传信息，

４突变体筛选，消除致死基因 2）DNA分子可在细胞内复制 植物激素（植物生长调节剂） 3）DNA分子可转录合成RNA。 1、生长素类：IAA，IBA，2，编码基因负责编码蛋白质或4-D，NAA等。

RNA，又叫结构基因 2、细胞分裂素类：KT，6-BA，植物组培的意义及发展 ZT等。 意义

3、赤霉素类；GA1-GA4，GA7，1）采用组细胞繁殖同嫁接，杆GA9-GA16，GA24，GA25等 插一样能保持原树体各种优良4、脱落酸：ABA 性状，且苗木性状，长势一致。 5、乙烯

2）可以大量，工厂化繁殖珍贵6、PH值：5.6-5.8 植物，频烦植物，难以繁植（无培养基按状态分 种子，难杆插）的植物种类。 固体培养基；液体培养基。 繁殖速度公式：y=m×xn。 按作用分：诱导培养基；增值 m—君菌母株数， x—每一

培养基、生根培养基。

周期增殖位数， 按培养过程分：初代培养基、n—周期次数。 继代培养基。

3）果树经济林等可以培养脱毒1、污染：植物组织培养过程中菌

培养基和培养材 料滋生杂菌，4）组培技术育种，胚乳培养是导致培养失败的现象 获得3倍体植株的重要途径 2、污染的原因

5）种质资源保存 大大节省一是病原菌污染（细菌、真菌） 土地、人力、资金 二是外植体、培养基、培养器6）植物生理代谢研究

皿带菌

7）转基因研究（基因工程） 三是操作人员未遵守操作规限制性内切核酸酶

程。

1型限制性内切核酸酶 植物遗传转化特点：

2型限制性内切核酸酶 不受亲缘关系的限制，可实现3型限制性内切核酸酶 动物，植物和微生物间遗传物切核酸酶的命名和分类

质交流，从而充分利用自然存利用属名的第一个字母和种名在的各种遗传资源，

的前2个字母代表内切酶来源，有效地打破有利基因和不利基(如大肠杆菌Eco;流感嗜血菌) 因的连锁，充分利用有用基因， 内切酶的第四个字母表示酶来加快育种进程，缩短育种年限。 源的菌株和菌型（如EcoRI中茎尖培养的意义 R就表示该内切酶来自于大肠1离体快速繁殖

杆菌的R菌株;有是可以加上数2用于植物茎尖脱毒培养无病字如EcoP1)

毒苗木

在同一菌株中分离获得的不同3诱变育种，用于普通繁殖方内切酶按照分离时间的先后以法，即使发生了突变，由于突罗马数字加以标注（如HindII） 变嵌合体的干扰，突变组~～ 限制性内切核酸酶在生物技术４用种质资源保存和携带

中的运用:

５用于无法用种子繁殖或用种1构建重组的DNA分子,

1


2探针的设备,

核酸的重要性质。指核酸双螺3 DNA物理图谱的构建,

旋链的氢键断裂，变成单链，质粒载体的一般生物学特性： 并不涉及共价键的断裂。 质粒DNA的复制； （多核苷酸骨架上共价键（3｀质粒DNA不亲和性； 5｀—磷酸二酯键）的断裂叫核质粒的DNA结合性，

酸的降解。降解引起核酸相对载体的本质是DNA复制子。作分子质量降低。） 为基因工程载体又须具备以下通常把加热变性使DNA的双3个基因条件：①能在宿主细胞螺旋结构失去一半时的温度称内进行独立和稳定的自我复。为DNA的溶点or熔解温度插入处源左因后仍然有着稳定（melting temperature），用Tm的复制状态和遗传状态。②具表示。DNA的Tm值一般在有合适的限制性内切酶位点，82—95℃之间， 且最好插入外源基因后不影响②复性 变性DNA在适当条载体复制。③具有合适的选择件下，又可以使两条彼此分开标记基因，用来筛选重组体的链重新缔合成为双螺旋结DNA。常用的是抗药性基因有构，这过程称复性（P16）。

（renaturation）。 质粒载体的构建原则;

热变性DNA缓慢冷却的过程1质粒载体具有自能我复制的称为退火（annealing）。 原件,

复性快慢以Cot1/2值来表示。2质粒载体上具有允许外源基Co为变性DNA复性时的初始因插入的多克隆位点,

浓度，以核苷酸的摩尔浓度表3质粒载体上同时必须有可供示；t为时间秒；Cot1/2表示复筛选的抗生素标记,

性一半的Cot值。 4构建质粒载体应该足够小. 结构基因（structune gene） 获得单倍体的意义:

以DNA为模板(编码基因)合成1在P育种中使后代迅速结合, RNA时的碱基序列。用于RNA2提高选择效率;

聚合酶(工作)开始时的识别与3排除杂种优势对后代选择的结合。生物化学上叫“走点”干扰;

（origin）。 4遗传研究的良好实验材料体mRNA翻译合成蛋白质。 系;

参与转录的调节基因5突变体的筛选, （regulation gent）依靠自身的6消除致死基因; 固有碱基序列结构,调节基因的7选育新型杂交系; 表达。除去启动子外还有： 8遗传转化的受体材料.

增强子（enhancer）：使DNA转离体快速繁殖商业性生产的范录加速。进入工作状态。 围及应用:

衰减子（attenuator）：使DNA1,用于稀缺或急需良种P的繁转录衰减的DNA序列。 殖,

终止子（terminator）：使DNA2用于茎尖脱毒及无病毒苗木转录终止的DNA序列。 试管快速繁殖

操纵基因（operator）：直接负3用于自然界无法用种子繁殖责DNA转录开启和关闭的或难以保持后代一致的三倍体,DNA序列。 单倍体及基因工程P的快速繁基因工程的基本操作程序为 殖,

（P7） 4濒危P的拯救. ①从供体生物的基因组中，分核酸的物理化学性质 离获得带有目的基因的DNA（1）核酸的水解

片段。 ①酸水解 DNA在PH1.6，②用限制性内切酶分别将外源37℃条件下对水透折即可完成DNA和载体分子切开。 酸水解（嘌呤与脱氧核糖之间③DNA连接酶将含有处源基因的糖苷键水解），而成为无嘌呤的DNA片段接到载体分子上，酸；

形成DNA重组分子。 ②碱水解 RNA的磷酸酯键易④将重组DNA分子引入到受被碱水解，产生单核苷酸。用体细胞。 于水解RNA的碱有NaOH、⑤带有重组体的细胞培养扩KOH等。碱浓度一般为增，获得大量的细胞繁殖群体。 0.3—1mol/L ，在室温至37℃⑥筛选和鉴定转化细胞，获得下水解18—24h就可完毕。如使处源基因高效稳定表达的基用高温则时间应缩短。水解产因工程菌或细胞。 物为2｀—和3｀—单核苷酸。作为基因工程载体又须具备以但也有少量2｀、5｀—和3｀下3个基因条件：①能在宿主5｀—核苷二磷酸。 细胞内进行独立和稳定的自我③酶水解

复。插入处源左因后仍然有着其分类方法是：a、按底物专—稳定的复制状态和遗传状态。性分，

②具有合适的限制性内切酶位 b、按对底物作用的方式 点，且最好插入外源基因后不 c、按磷酸二酯键断裂的方影响载体复制。③具有合适的式

选择标记基因，用来筛选重组 d、其它分类标准 体DNA。常用的是抗药性基因（2） 核酸的紫外吸收

有（P16） （3）核酸的变性，复性及杂交 理想质粒载体的又备条件。①变性（denaturation）作用是（P44）

1）具有较小的分子质量和较高小于0.5mmol/L的元素为微量

的拷贝数。低分子质量表现易元素。

于操作，转移（在细胞间）；高3）有机化合物：包括有，炭水拷贝数有利于质粒DNA的制化合物，植物生长调节剂，维备，增加克隆基因剂量。 生素类，氨基酸等 2）具有若干限制性核酸内切酶a.炭水化合物 的单一酶切位点。 b生长调节剂

3）具不两种以上的选择标记基 ①生长素类：IAA（吲哚，乙因。易于对宿主细胞进行选择、酸），IBA（吲哚丁酸），NAA鉴别。 （萘乙酸，2，4—D（2，4—二4）缺失mob基因，这样质粒就氯苯乙酸）） 不会从一个细胞随便转移到加 ②赤霉素类 一细胞，减少基因扩散的危险 ③细胞分裂素

性。 c、肌醇类（inositol）环己六醇 5）插入外源基因的重组质粒易VB复合体的一种，可促进营养导入宿主细胞并复制和表达。 生长合作浓度100mg/l多用。 Ti质粒的结构和功能 d 维生素类 章鱼碱型（octopine）、胭脂碱e、氨基酸类 型（nopaline）、农杆碱型4）天然物， （agropine）和农杆菌素碱型5）活性炭

(agrocinoine)或称琥珀碱型4.3.2.2培养体的支持材料

（succinamopine）

琼脂（石花胶，洋粉、洋Ti质粒的结构与功能可分为下菜）

述4个区段 纸桥（纸架） 1）毒性区（virulence region）培养基制备

又称Vir区。位于T—DNA左（1）培养基种类

侧， （2）培养基的组成及用途 2）T—DNA区 （3）培养基配制

（transferrde-DNAregion） 长（4）生长调节剂的添加 度约15~30kb,相当于Ti质粒方法Ⅰ NAA、BA、

DNA全长的1/10。 称取50mg加入200ml的50℃3）接合转移区（encoding 温水中，搅拌至全溶解，再少conjugation region,）

量地加水到500ml，加盖摇动、4）复制起始E（origin of 分裂到50支10ml塑料试管中，replication region,ori）可保证Ti冷冻保存，每支1mg量。 质粒进行自我复制。 方法Ⅱ NAA、BA、GA类 目的基因导入方法: 称50mg，用丙酮（acetone ）农杆菌介导法 或95%工业酒精。5~10ml溶解1）叶盘转化法（leaq dish 后，慢慢加水到500ml分注。 transformation）是Monsanto公方法Ⅲ 2.4-D,IAA,IBA

司Morsch等人（1985年） 称取50mg，用95%酒精1ml2）整株感染法 溶解。少量加水后液体变白混3）原生质体转化法

浊时，再少量加入酒精，液体基因枪法（gene gun）又称微变透明。再绶慢加入水变白浊弹轰击法（micrkprojectile 时，再少量加酒精，一透明，bomboard ment）粒子轰击法如此反复，到加水后淮体不变（partide bombardment）是借折浊时，绶惭加水到500ml。助高速金属微粒将DNA分子分注。

引入活细胞的转化技术。 方法Ⅳ BA（激动素）

花粉管通道法（pollen-tube 称取50mg，用0.1克分子量pathway） HCL 2ml溶解，温水绶慢加入3.3.4 聚乙二醇法（PEG） 边搅拌到500ml。分注保存。3.3.5 电击法（electroporation） 用时取出，放入水中溶解后加 也称电穿孔法，是利用高入培养液，注意冲洗塑料小瓶。 压电脉冲作用是细胞膜上形成试剂秤取方法，1ml以下时，可逆性瞬间通道，从而使外源为减小误差，准确称取较难，DNA分子进入细胞的转化方应先以10倍量称取。用100ml法。 定容。用移液管（吸管）取10ml实验室投备，及基本材料操作定容。

技术。

4.3.4使用器具的减菌 4.3.1实验室及基本设备 4.4 茎尖培养

4.3.1.1实验室结构 组织培养中外植体取自植1）准备室 物茎尖生长点叫茎尖培养,根据2）无菌室 组培的目的，及难易程度茎尖3）培养室

培养分生组织的大小从10~1004）驯化室（移苗室） υm。

培养基的主要成分 4.4.1茎尖培养的意义 1）水

1）离体快速繁殖 2）无机盐

2）用于植物茎尖脱毒培育无病 有氨N，磷P，钾K，钙Ca，毒苗木 硫S，镁Ma等大量元素。微量

元素：铁Te、锌Zn、锰Mn、3）诱变育种 用普通繁殖方硼B、碘I、钼MN、钴Co 法，即使发生了突变，由于突植物所需要的浓度大于变嵌合体的干扰，突变组 0.5mmol/L的元素为大量元素，4）种质资源保存和携带，

2

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